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ELISA檢測方法步驟

ELISA是一種用于檢測和定量蛋白質、抗體、抗原的免疫學方法，廣泛應用于生物醫學研究和診斷中。然而，對于剛接觸ELISA新手來說，復雜的實驗步驟和細節常常讓他們感到困惑。接下來，我們將逐步講解ELISA的操作步驟。  <img src="/images/upload/Image/5(47).png" alt="酶聯生物ELISA試劑盒" width="500" height="375" /> <h3>　　實驗步驟<o:p></o:p></h3>   　　 一、實驗試劑準備<o:p></o:p>   　　1.抗原/抗體:根據實驗目的和ELISA類型(例如夾心法、間接法、競爭法)，選擇合適的抗原或抗體。<o:p></o:p>   　　2.96孔板:高結合力的聚苯乙烯微孔板，用于吸附抗原或抗體。<o:p></o:p>   　　3.酶標二抗:與目標抗體/抗原結合的酶標二抗，例如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)標記的二抗。<o:p></o:p>   　　4.封閉液:用于封閉微孔板未結合位點，減少非特異性結合。常用5%BSA（牛血清白蛋白）PBS溶液或脫脂奶粉PBS溶液。<o:p></o:p>   　　5.酶底物:用于與酶標二抗上的酶反應，產生可檢測的信號。HRP常用TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺），AP常用pNPP（對硝基苯磷酸）。<o:p></o:p>   　　6.酶反應終止液:用于終止酶促反應。HRP常用2N硫酸溶液。<o:p></o:p>   　　7.洗滌液:用于洗滌未結合的抗體或抗原，常用0.05%PBST(PBS溶液+0.05%Tween20)。<o:p></o:p>   　　8.樣品稀釋液:根據樣品的不同，選擇合適的稀釋液。<o:p></o:p>   　　9.標準品(可選):如果需要進行定量分析，則需要準備一系列已知濃度的標準品，用于繪制標準曲線。<o:p></o:p>   　　二、實驗步驟 <o:p></o:p>   　　1.包被抗體/抗原<o:p></o:p>   　　配制合適濃度的抗原或抗體（通常1-10µg/mL），濃度需要通過預實驗進行確定。用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）稀釋。<o:p></o:p>   　　向96孔板中每孔加入合適的體積（例如50-200µ）稀釋好的抗原或抗體溶液。<o:p></o:p>   　　在4°C或37°C孵育過夜或2小時，讓抗原/抗體吸附到板子上。孵育時間和溫度需要根據具體情況進行優化。<o:p></o:p>   　　三、洗板<o:p></o:p>   　　用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗板，重復以下步驟3-5次，或根據需要增加洗滌次數，以確保充分去除未結合的物質：<o:p></o:p>   　　①、棄去孔內液體。<o:p></o:p>   　　②、用足量的洗滌液(例如200-300µL/孔)充滿每孔。<o:p></o:p>   　　③、靜置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　　④、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。<o:p></o:p>   　　四、封閉<o:p></o:p>   　　每孔加入200µL封閉液，例如1%-5%BSA或脫脂奶粉的PBS/PBST溶液。在室溫下孵育1-2小時，或4°C過夜孵育。孵育結束后，進行洗板操作：<o:p></o:p>   　　①、棄去孔內液體。<o:p></o:p>   　　②、用洗滌液(例如0.05%PBST)注滿每孔。<o:p></o:p>   　　③、靜置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　　④、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。重復洗板步驟3-5次。<o:p></o:p>   　　五、加樣品或標準品<o:p></o:p>   　　使用樣品稀釋液或標準品稀釋液（通常與封閉液成分相同）按照合適的稀釋梯度（例如2倍、3倍、5倍等）稀釋待測樣品或標準品。對于定量ELISA，需要準備一系列已知濃度的標準品，并進行梯度稀釋，用于繪制標準曲線。<o:p></o:p>   　　每孔加入100µL稀釋后的樣品或標準品。設置空白對照孔，不加樣品或標準品，只加稀釋液。<o:p></o:p>   　　在室溫下孵育1-2小時，或37°C孵育30-60分鐘。孵育時間和溫度需要根據具體的抗原抗體進行優化。<o:p></o:p>   　　六、加檢測抗體（對于夾心法）<o:p></o:p>   　　孵育完樣品后，進行洗板操作：<o:p></o:p>   　　①、棄去孔內液體。<o:p></o:p>   　　②、用洗滌液(例如0.05%PBST)充滿每孔。<o:p></o:p>   　　③、靜置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　　④、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。重復洗滌步驟3-5次。<o:p></o:p>   　　⑤、加入用抗體稀釋液(通常與封閉液成分相同)稀釋好的檢測抗體(結合靶標抗原的酶標抗體)，每孔100µL。抗體的稀釋倍數需要根據具體的抗體和實驗條件進行優化。<o:p></o:p>   　　⑥、在室溫或37°C下孵育1-2小時。具體孵育時間和溫度需要根據具體的抗體進行優化。<o:p></o:p>   　　⑦、孵育結束后，再次進行洗板操作(步驟同上)。<o:p></o:p>   　　七.加酶標二抗<o:p></o:p>   　　使用抗體稀釋液（通常與封閉液成分相同）稀釋酶標二抗。加入稀釋好的酶標二抗（結合檢測抗體的酶標抗體），每孔100µL。二抗的稀釋倍數需要根據具體的抗體和實驗條件進行優化。<o:p></o:p>   　　在室溫或37°C下孵育30分鐘至1小時。具體孵育時間和溫度需要根據具體的二抗進行優化。<o:p></o:p>   　　孵育結束后，進行洗板操作：<o:p></o:p>   　　①、棄去孔內液體。<o:p></o:p>   　　②、用洗滌液(例如0.05%PBST)充滿每孔。<o:p></o:p>   　　③、靜置1-2分鐘。<o:p></o:p>   　　④、棄去洗滌液，并用吸水紙小心拍干板子，避免交叉污染。重復洗板步驟3-5次。<o:p></o:p>   　　八.加底物反應<o:p></o:p>   　　根據試劑盒說明書準備酶底物溶液。加入100µL酶底物溶液（如TMB）到每孔，避光反應一段時間，通常為5-30分鐘，或直至出現明顯的顏色變化(例如，對于TMB底物，顏色會從無色變為藍色)。密切觀察顯色情況，并根據試劑盒說明書和標準品的顯色情況來確定反應時間。<o:p></o:p>   　　九.終止反應<o:p></o:p>   　　根據試劑盒說明書加入終止液，以終止反應，停止底物顯色反應。顏色變化取決于所使用的底物。例如，使用TMB底物時，加入2N硫酸后，顏色會從藍色變為黃色。<o:p></o:p>   　　十.測定吸光值<o:p></o:p>   　　使用已校準的酶標儀，根據試劑盒說明書選擇合適的檢測波長和參考波長，讀取各孔的吸光值（OD值）。讀取吸光值后，需要對數據進行分析，例如繪制標準曲線、計算樣品濃度等。<o:p></o:p>   <h3>　　實驗注意事項：<o:p></o:p></h3>   　　1.重復性：進行足夠的重復實驗，例如至少三個技術重復（同一份樣品在同一塊板上進行三次測定）或三個生物學重復（三個不同的樣品分別進行測定）。技術重復可以評估實驗的精確度，而生物學重復可以評估實驗的重復性。<o:p></o:p>   　　2.溫度控制：在孵育階段，溫度對結果的影響較大。建議使用培養箱進行孵育，以獲得更精確的溫度控制。如果在室溫下孵育，則盡量保持穩定的室溫，避免較大的溫度波動。<o:p></o:p>   　　3.洗滌：每次洗板時，確保洗滌液完全覆蓋每個孔。洗滌時，可以輕輕拍打板子邊緣，以去除殘留液體，或使用洗板機進行洗滌。注意避免交叉污染。<o:p></o:p>   　　4.顯色時間控制：顯色反應時間對結果有很大影響。密切觀察顯色情況，并根據試劑盒說明書和標準品的顯色情況來確定最佳反應時間。當標準品孔出現明顯的梯度顏色變化時，即可終止反應。<o:p></o:p>   　　5.試劑質量：使用高質量的試劑對于獲得可靠的實驗結果至關重要。<o:p></o:p>   　　6.操作規范：嚴格按照操作規程進行實驗，避免人為誤差。<o:p></o:p>   　　7.標準曲線：對于定量ELISA，標準曲線的質量直接影響樣品濃度的計算結果。確保標準曲線線性良好，并選擇合適的擬合方法。<o:p></o:p>   　　上述是ELISA檢測方法步驟，ELISA實驗操作包括包被、封閉、加樣、洗板、顯色等多個步驟。實驗完成后，通過標準曲線擬合和計算，可以準確獲得樣品中的目標分子濃度。在實驗中要注意些事項。關于標準曲線擬合和計算，下篇文章繼續為您介紹。<o:p></o:p>

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