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公司資訊

PCR技術基本原理與流程

PCR是一種高度靈敏的技術，能夠快速擴增特定的DNA片段。它可以產生數十億個目標DNA片段的拷貝，這些拷貝隨后可用于各種下游應用，例如通過基于大小和電荷的視覺技術（如凝膠電泳）進行檢測，并通過測序技術進行序列鑒定。   <h3>    PCR技術基本原理<o:p></o:p></h3>       PCR技術的原理是模擬DNA的體內復制過程，利用耐高溫DNA聚合酶復制特定的DNA片段。PCR的特異性主要依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物，并受到反應條件的影響。PCR由三個基本反應步驟組成：變性-退火-延伸：<o:p></o:p>       變性：模板DNA變性步驟中，反應體系被加熱至特定的高溫(通常為94-96℃)，持續一定時間(通常為15-30秒)。高溫使雙鏈DNA解鏈成單鏈，暴露出堿基序列，以便引物在后續步驟中與靶序列結合，為下一步的延伸反應做準備。具體的變性溫度和時間需要根據模板DNA的特性和所使用的DNA聚合酶進行優化，以確保完全變性和避免DNA的降解。<o:p></o:p>       退火：在退火步驟中，反應體系溫度降低至特定溫度(通常在45-65℃之間)，使引物能夠通過氫鍵與模板DNA單鏈上的互補序列特異性結合。最佳退火溫度取決于引物的長度、GC含量以及引物與模板的同源性，通常比引物的熔解溫度(Tm)低5-10℃。合適的退火溫度對于PCR反應的特異性和效率至關重要。<o:p></o:p>       延伸：在延伸步驟中，反應溫度升至DNA聚合酶的最適反應溫度(例如TaqDNA聚合酶為72℃)。DNA聚合酶以dNTP為原料，以引物3'端為起點，沿著模板DNA5'到3'方向合成新的互補DNA鏈。重復變性-退火-延伸三個步驟的循環，可以使目標DNA片段呈指數級擴增。每個循環的持續時間取決于PCR儀的性能和每個步驟的設定時間。典型的PCR反應在2-3小時內可以進行25-35個循環，將目標DNA擴增數百萬倍。除了常用的TaqDNA聚合酶外，現在還有許多其他類型的DNA聚合酶可供選擇，例如具有3'到5'外切酶活性、能夠進行校對的高保真DNA聚合酶。<o:p></o:p>       標準PCR流程包含三個核心步驟，這些步驟會重復循環25-35次以實現目標DNA片段的指數級擴增：<o:p></o:p>       DNA變性(Denaturation):將反應體系加熱至94-95℃，持續15-30秒，使雙鏈DNA模板在高溫作用下斷裂氫鍵，解旋成單鏈DNA，為引物結合提供模板。<o:p></o:p>       退火(Annealing):將反應體系冷卻至特定溫度(通常比引物的熔解溫度Tm值低5-10℃，一般在45-65℃之間)，持續30-60秒。在此溫度下，引物通過氫鍵與單鏈DNA模板上的互補序列特異性結合，形成局部雙鏈。退火溫度的精確設定對于PCR的特異性至關重要。<o:p></o:p>       延伸(Extension):將反應體系加熱至DNA聚合酶的最適反應溫度(例如TaqDNA聚合酶為72℃)，持續30-60秒(延伸時間取決于目標片段的長度)。在此溫度下，DNA聚合酶以dNTP為原料，以結合到模板上的引物3'端為起點，沿著模板DNA5'到3'方向合成新的互補DNA鏈。<o:p></o:p>       每個PCR循環理論上可以使目標DNA含量增加一倍。兩步法PCR可以縮短反應時間，但其應用的前提是使用在較高溫度下仍具有足夠延伸活性的DNA聚合酶。這種方法并非適用于所有情況，尤其不建議在使用普通Taq酶的情況下僅僅因為擴增區域短就采用兩步法，因為Taq酶在較低溫度下的活性不足，可能導致PCR效率降低。選擇兩步法PCR需要根據所使用的DNA聚合酶的特性和反應體系進行優化。<o:p></o:p>

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