RNA逆轉錄實驗5大注意事項

<p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; RNA逆轉錄實驗看似簡單，卻常常因為一些細節問題導致結果不理想，甚至實驗失敗。本文將揭示RNA逆轉錄實驗中常見的5大誤區，幫助您避開這些陷阱，獲得高質量的實驗結果。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 1.防止RNA模板降解</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 毫無疑問，RNA的質量對cDNA合成的結果有著重要的影響。但RNA本身比較脆弱，容易降解。為了保證RNA的完整性，需要謹慎小心，例如在冰上操作、減少操作時間等。在反應體系中添加抑制劑也能有效防止RNA降解。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 另外，建議在逆轉錄前通過瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA條帶的質量。通常完整的真核RNA應該包含28S和18S條帶，且28S條帶的強度一般約為18S的兩倍。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 2.RNA定量</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 除了掌握RNA的完整性外，逆轉錄前還需要測定RNA的濃度。一般逆轉錄試劑盒對上樣量都有要求，建議總RNA上樣量小于5&mu;g。超過此范圍會造成逆轉錄產物的偏向性（表達豐度高的基因優先被逆轉錄），從而導致定量結果不準確。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 3.去除基因組DNA污染</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 殘留的基因組DNA（gDNA）會嚴重干擾熒光定量結果。為了使結果更真實、可重復，需要去除gDNA干擾。可以在引物設計時避免gDNA擴增，例如將上下游引物設置在不同的外顯子上；或在RNA提取后使用DNaseI去除gDNA。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 4.選擇合適的引物</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; OligodT引物和隨機引物均可進行逆轉錄。OligodT引物僅能結合mRNA3'端的poly(A)，不受rRNA和tRNA的干擾，特異性強。但其對RNA的完整性和二級結構要求較高，不適用于原核生物。隨機引物幾乎可以結合任何RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA，具體取決于堿基。但隨機引物法逆轉錄產生的片段較小，難以獲得全長轉錄本的cDNA。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 5.逆轉錄酶的熱穩定性</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 逆轉錄酶在整個逆轉錄體系中起著關鍵作用。除了活性之外，逆轉錄酶的熱穩定性也至關重要。在較高溫度下進行逆轉錄可以降低RNA的二級結構，提高逆轉錄效率。野生型M-MLV逆轉錄酶非常&ldquo;耐熱&rdquo;，當溫度高于37℃時，其穩定性會大大降低。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; RNA逆轉錄實驗的成功與否，往往取決于細節。牢記這5大注意事項，讓您的PCR實驗事半功倍，高效獲取高質量數據。</span></p>