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別忽視 ELISA 洗滌！這可能是實驗成敗的關鍵

ELISA檢測的關鍵點之一是洗滌步驟。洗滌能去除未結合的酶標抗體，否則這些抗體會在后續步驟中與底物反應，產生非特異性信號，從而抬高背景值。每個步驟之間的洗滌確保只有與目標抗原特異性結合的酶標抗體被保留在微孔中，使最終的顯色反應只反映目標抗原的含量。洗滌不充分會導致重復孔之間結果的變異系數增大(例如，>10%)，以及背景吸光度值顯著高于空白對照(例如，>0.2)，高的背景信號會掩蓋真實的信號，導致假陽性或低估目標抗原的濃度，最終影響實驗結果的可靠性。  <img src="/images/upload/Image/ELISA檢測基本步驟.jpg" alt="ELISA洗滌步驟" width="391" height="332" />     做ELISA實驗，洗板有2種方法：手動洗板和洗板機洗板。兩者沒有本質區別，只要操作符合要求，就能得到正確可靠結果。<o:p></o:p>   <h3>    手動洗板<o:p></o:p></h3>       手動洗板人為因素較大，實驗人員必須經驗豐富，洗板次數要充足，沖擊力不宜過大。洗板液加入量以剛好填滿反應孔為宜，防止孔內游離酶被沖走，同時防止液體跨孔流動。洗板后擦干也非常重要，否則可能造成假陽性。每次洗板后，用吸水紙輕輕拍干。垂直握持板子，避免交叉感染。用力不宜過猛，防止抗原抗體復合物脫落；吸水紙應一次性使用，且最好使用不易脫落碎屑的吸水紙。酶結合物不耐干燥，尤其在較高溫度下更容易失活。因此，拍干的反應板應盡量縮短暴露在空氣中的時間，時間越長，吸光度值越低。<o:p></o:p>       手動操作有浸泡、流水沖洗兩種方式：<o:p></o:p>       浸泡清洗<o:p></o:p>       1.吸干或旋轉干燥孔內的反應溶液；<o:p></o:p>       2.用洗滌液清洗一次（將洗滌液注滿孔內，然后倒掉）；<o:p></o:p>       3、浸泡，即將洗液注滿板孔，靜置1～2分鐘，間歇搖晃，浸泡時間不可隨意縮短；<o:p></o:p>       4.吸干孔內的液體。徹底吸干，可以使用水泵或真空泵，也可以將液體抖掉，然后用干凈的毛巾或吸水紙拍干；<o:p></o:p>       5.重復步驟3和4，洗滌3至4次（或按說明書規定）。間接法中，如果背景較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。<o:p></o:p>       微量滴定板多采用浸泡洗滌法，洗滌液多為含有非離子去垢劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水的，非離子去垢劑同時含有疏水基團和親水基團，疏水基團通過疏水鍵與蛋白質的疏水基團結合，從而減弱蛋白質與固相載體的結合。親水基團與水分子結合，使蛋白質重新回到水溶液狀態，從而脫離固相載體。<o:p></o:p>       洗滌液中的非離子去垢劑通常為Tween20，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時可使包被在固相上的抗原或抗體解吸，降低檢測靈敏度。<o:p></o:p>       流水沖洗型<o:p></o:p>       流水沖洗法最初用于清洗珠子載體，洗滌液只有蒸餾水甚至自來水。洗滌時會附加一個特殊的裝置，使珠子在流水的沖擊下不斷翻滾沖洗。持續沖洗2分鐘后，吸收液體，再在蒸餾水中浸泡2分鐘，吸干。浸泡式就像浴缸，流水沖洗式就像淋浴。清潔效果更徹底，也更簡便快捷。<o:p></o:p>       實驗證明，流水沖洗同樣適用于清洗酶標板。清洗時，盡量加大水流量或增加水壓，使水流沖擊到板孔表面，清洗效果會更好。<o:p></o:p>   <h3>    洗板機<o:p></o:p></h3>       洗版機洗版人為因素少，速度快，條件恒定。但是，使用洗版機洗版時應注意以下三個關鍵點。<o:p></o:p>       洗滌參數<o:p></o:p>       主要參數是洗滌液體積。自動洗板機分配洗滌液。如果您之前遇到過高背景，請毫不猶豫地將洗滌液體積設置為較高，最好高于包被體積。洗滌液太少會導致部分分析表面未被清洗，從而顯著增加背景。所有反應孔的洗滌液體積必須相同。<o:p></o:p>       洗滌時間<o:p></o:p>       影響洗滌結果的主要參數是洗滌次數。當然，洗滌次數越多，背景越低。然而，洗滌次數過多會降低信號強度，導致難以測量。通常的做法是每次抗體或抗原孵育后重復洗滌三次。但一般來說，包被板所需的洗滌次數比用戶包被板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優化洗滌次數。<o:p></o:p>       控制洗滌量和次數的另一種方法是添加過量的洗滌液。通常，96孔板的每個孔可容納330至460µl的洗滌液。然而，一些自動洗板機可以編程分配遠高于此量的洗滌液，例如1ml。具體怎么做呢？其實很簡單，只需在分配液體時打開抽吸功能即可。換句話說，當分配器分配更多液體時，抽吸器也會將液體抽出。這項技術可以提高洗滌容量，而不會將液體濺到其他孔中。<o:p></o:p>       還有一些參數會影響清洗步驟的性能。這些參數包括吸液高度和吸液位置，兩者都可以調整，以減少背景（殘留）和差異。<o:p></o:p>       殘留液體含有未結合的抗原或抗體，可能會增加背景信號。殘留量越少，剩余液體越少，轉移到下一步驟的干擾液體也就越少。<o:p></o:p>       吸液高度會顯著影響殘留量，清洗吸頭與反應孔底部距離稍大，殘留量會急劇增加；反之，清洗吸頭緊貼反應孔底部，也會降低吸液效率，殘留量增加。<o:p></o:p>       目前洗板機通常使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭的吸頭在清洗過程中可以自由上下移動，而剛性洗頭則固定不動。使用剛性洗頭的清洗操作優化起來更加復雜，因為您需要非常仔細地調整吸頭高度。如果您的實驗室使用多塊不同的板，這可能會非常耗時。使用浮動洗頭時，吸頭會下降到反應孔的底部。<o:p></o:p>       吸液位置對殘留量也有顯著影響；如果每個孔只使用一個吸液點（由于速度更快，這種情況很常見），則需要優化吸液位置。最佳位置取決于洗頭的特性，但很少位于反應孔的中間，盡管這是所有洗頭最常見的默認位置。一般來說，最佳位置位于孔的中間和孔壁之間。<o:p></o:p>       反應孔的形狀也會影響殘留量。C形底部（平底、圓角）的微孔板的殘留量通常低于平底、尖角的微孔板。<o:p></o:p>

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