簡介
蓖麻是大戟科蓖麻屬植物，是重要的油料作物，除蓖麻油外，其種子含有大量的蓖麻毒素。蓖麻毒素系指蓖麻毒蛋白、蓖麻堿、蓖麻變應原和血球凝集素四種毒性物質，其中蓖麻毒蛋白的毒性最大。在藥物研究中，蓖麻毒蛋白又稱蓖麻毒素，為具有兩條肽鏈的高毒性的植物蛋白；它易損傷肝、腎等實質器官，發生出血、變性、壞死病變，并能凝集和溶解紅細胞，抑制麻痹心血管和呼吸中樞，是致死的主要原因之一。
本試劑盒蓖麻毒素免疫測定是一種兩步法90分鐘固相ELISA，用于測量細胞培養上清液、血清和血漿中的蓖麻毒素。試劑盒包含大腸桿菌表達重組蓖麻毒素和針對重組蛋白產生的抗體。使用天然蓖麻毒素獲得的結果顯示出與使用重組標準品獲得的標準曲線平行的線性曲線。這些結果表明，該試劑盒可用于測定天然蓖麻毒素的相對質量值。
檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術:將蓖麻毒素 (RIC) 捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的RIC，加入辣根過氧化物酶標記的抗RIC抗體，與RIC結合形成“抗體-抗原-抗體-HRP”免疫復合物，加入TMB顯色后，若樣本中有RIC則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的蓖麻毒素 (RIC) 的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中RIC的濃度。
雙抗體夾心模式圖
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按操作順序形成抗體夾心結構后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變為黃色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、操作人員、移液技術、洗滌技術、培養時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設計消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
混合蛋白質溶液時，應始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。此外，每種試劑應單獨使用容器。
確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準確的結果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉180度，可以提高測定精度。
顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應從無色變為藍色。
應按照與顯色劑相同的順序將終止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變為黃色。綠色的孔表示終止液未與基質溶液充分混合。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水
4.100-1000 mL刻度量筒。
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機。
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
注意事項
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
樣品預處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩定性尚未評估。
細胞培養上清液：
以1000×g離心20分鐘，去除顆粒，立即進行測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環。（由于基質效應，細胞培養上清液樣品建議10倍稀釋。例如：20μL樣品+180μL的1×稀釋液）
血清：使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進行測定或等分裝樣品，將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環。（由于基質效應，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
血漿：
使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內，以1000×g離心15分鐘。立即測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復凍融循環。（由于基質效應，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
注：檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經驗證可用于本試驗，使用時應自行驗證可行性。溶血的樣品不適合用于該測定。
組織勻漿：用預冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響檢測結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
細胞裂解液：
貼壁細胞用預冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用預冷PBS清洗3次，每1×106個細胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當減少PBS體積）并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
其它樣本類型：
1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置：
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將12ng/mL標準品（200uL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至640pg/mL（例：53uL的標準品母液+947uL的1×稀釋液，制備得到1000μL的640pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將640pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為： 640pg/mL，320pg/mL、160 pg/mL、80pg/mL、40pg/mL、20pg/mL、10pg/mL、從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。
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酶標抗體工作液配置:
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標抗體稀釋成1×酶標抗體工作液，根據所需用量配置。
備注：
如待測樣本中RIC濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數 (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數) ；標準品母液及100×酶標抗體溶液根據實驗所需酶標板孔數吸取一定量配置工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結果的穩定性）
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1. 酶標板準備：確定試驗所需要的孔數，取下未使用的酶標條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。
2. 樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標準品以及預處理過的待測樣品，蓋上封板膠紙在37℃下孵育45分鐘。孵育結束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
3. 二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙在37℃下孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟2中的清洗方式清洗4次。
4. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙在37℃下避光孵育10-20分鐘。（根據樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
5. 終止反應：待顯色反應結束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1.加標準品及樣品，37℃反應45分鐘，洗滌3次。
2.加酶標抗體，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內讀數。
精密度
操作內精密度（測定中的精密度）在一塊平板上對兩個已知濃度的樣品進行20次測試，以評估測定內精密性。
操作間精度（測定間精度）在10個單獨的測定中測試兩個已知濃度的樣品，以評估測定間精度。至少有三名技術人員進行了實驗。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。
精密度
操作內精密度：(測定中的精密度)在一塊平板上對兩個已知濃度的樣品進行20次測試，以評估測定內精密性。
操作間精度：(測定間精度)在10個單獨的測定中測試兩個已知濃度的樣品，以評估測定間精度。至少有三名技術人員進行了實驗。
回收率
回收率在不同基質的整個測定范圍內選取在健康小鼠血清、血漿和細胞培養上清中加入3個不同濃度水平的蓖麻毒素，計算回收率。
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為10pg/mL
線性關系
分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細胞培養上清中加入高濃度蓖麻毒素，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。
特異性
該試劑盒測定可識別天然和重組蓖麻毒素。
其他相關因子在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。
實驗步驟匯總
1.加標準品及樣品，37℃反應45分鐘，洗滌3次。
2.加酶標抗體，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內讀數。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
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