呋喃妥因代謝物(AHD)ELISA試劑盒
簡介
硝基呋喃類藥物是人工合成的光譜抗生素，有非常好的抗菌作用，曾被廣泛應用于水產、禽類等的藥物和促生產的飼料添加劑。但近來的科學研究表明，硝基呋喃類藥物及其代謝物可以使實驗動物發生癌癥和基因突變，因此中國、歐盟、WHO等眾多國家和組織禁止食用動物中使用硝基呋喃。硝基呋喃類藥物進入動物體內后很快轉為代謝物，常用檢測呋喃妥因殘留的方法是測定代謝產物AHD和鄰硝基苯甲醛的衍生物（NP-AHD）。
本酶聯免疫檢測試劑盒可以經濟、快速地檢測動物組織（肌肉、肝臟）、蜂蜜等樣品中的呋喃妥因代謝物的殘留量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中呋喃妥因和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭呋喃妥因抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。隨后結合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的呋喃妥因成負相關。通過標準曲線可準確定量樣品中呋喃妥因的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數即為實際樣品中呋喃妥因的含量。
間接競爭法模式圖
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按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變為黃色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、操作人員、移液技術、洗滌技術、培養時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉180度，可以提高測定精度。
顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應按照與顯色劑相同的順序將終止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變為黃色。藍色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋、移液槍
試劑：氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、乙酸乙酯、濃HCL、正己烷、二硝基苯甲醛
注意事項
此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。
該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
樣品預處理
樣本前處理需配液：
1.1mol/L鹽酸溶液：量取8.6mL濃鹽酸，加蒸餾水定容至100mL。
2.衍生化試劑：稱取0.15g二硝基苯甲醛，加甲醇100mL溶解，4℃避光保存。
3.0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液：稱22.8g磷酸氫二鉀，加蒸餾水溶解，定容至1000mL。
4.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4.0 g氫氧化鈉，加蒸餾水定容至100mL。
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導。樣品穩定性尚未評估。
1.魚蝦和肉樣樣本
（1）稱取均質后的組織樣本1±0.05g于50mL離心管中，依次加入4ml的蒸餾水，0.5mL 1mol/L HCL溶液和100µL衍生化試劑，充分振蕩3min。
（2）置于60℃水浴鍋中孵育1h（注意避光）。
（3）取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，0.4ml 1mol/L 氫氧化鈉溶液和6mL乙酸乙酯，充分混勻1min，4000r/min離心10min（如出現乳化現象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉速和延長離心時間重復離心）。
（4）移取上層溶液3mL于5ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干。
（5）吹干后加入2mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心10min；去除上層正己烷相（如出現乳化現象，則重復離心）
（6）取50µL下層用于分析。
樣品稀釋倍數：2倍
2.蜂蜜樣本
（1）稱取均質后的組織樣本2±0.05g于50mL離心管中，依次加入4ml的蒸餾水，0.5mL 1mol/L HCL溶液和100µL衍生化試劑，充分振蕩3min。
（2）置于60℃水浴鍋中孵育1h（注意避光）。
（3）取出后依次加入5mL 0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液，0.4ml 1mol/L 氫氧化鈉溶液和6mL乙酸乙酯，充分混勻1min，4000r/min離心10min（如出現乳化現象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉速和延長離心時間重復離心）。
（4）移取上層溶液3mL于5ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進行吹干。
（5）吹干后加入2mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心10min；去除上層正己烷相（如出現乳化現象，則重復離心）
（6）取50µL下層用于分析。
樣品稀釋倍數：1倍
此方法與呋喃唑酮代謝物、呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物試劑盒可合一處理。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配制：
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先將1000ppb標準品（200µL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8.1ppb（例：8.1µL的標準品母液+991.9µL的1×稀釋液，制備得到1000μL的8.1ppb濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入400μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將8.1ppb標準品依次3倍倍比稀釋至7個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：8.1ppb、2.7ppb、0.9ppb、0.3ppb、0.1ppb、0.03ppb、0.01ppb，從最高濃度標準品溶液中吸取200μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據所需用量配置。
酶標二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據所需用量配置。
備注：
如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數 (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據實驗所需酶標板孔數吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標準品/預處理過的待測樣品，同時加入一抗試劑50µL/孔（加一抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟1中的清洗方式清洗4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4.終止反應：待顯色反應結束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
精密度
批內精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。
批內變異系數 CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。
批間變異系數 CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.01 ppb。
線性關系
校準品劑量反應曲線相關系數 r 值，大于等于 0.9990。
交叉反應性
呋喃妥因：100%
實驗步驟匯總1.加標準品/樣品和一抗，37℃反應30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標二抗，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內讀數。
結果的計算
以濃度的對數為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出四參數邏輯函數的標準曲線。或者使用能夠生成四參數邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
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