兔角膜上皮細胞試驗原理：
兔角膜上皮細胞是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知待測物質濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將待測物質和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中待測物質的濃度呈比例關系。
試劑盒內容及其配制
自備材料
1）蒸餾水。
2）加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
1）避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2）實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3）不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項
1）試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2）實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3）不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4）使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6）洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7）底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8）加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9）按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
樣品收集、處理及保存方法
1）血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2）血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
3）細胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4）組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液
5）保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70
℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
試劑的準備
1）標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。
2）洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
操作步驟
1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2）根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內。
3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9）在450nm波長處測定各孔的OD值。
局限
6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到精確的結果。
試劑盒性能
1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內、板間變異系數均小于10%。
結果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應的待測物質標準品濃度為橫坐標（X），做得相應的曲線，樣品的待測物質含量可根據其OD值由標準曲線換算出相應的濃度。
用戶評論(共6條評論)
酶聯生物經過不斷的實驗優化和改進，積累了大量的經驗，擁有專業的酶聯研發團隊。利用專業的酶聯免疫技術自主研發的elisa試劑盒，能對血清及其它樣本定量檢測抗原，定性檢測特異性抗體。優質的試劑，先進的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件。ELISA檢測的方便性、穩定性、重復性和可靠性方面都具有很大的優勢。
ELISA檢測技術服務內容：
1、雙抗體夾心法檢測抗原 2、間接法檢測抗體 3、為客戶提供各種ELISA技術進行樣本檢測。
以上代測費，凡購買本公司試劑盒，我們免費代測！
凡購買本公司目錄任何一種酶聯免疫檢測試劑盒，您只需將需要檢測的動物（Human, Rat, Mouse, Rabbit, Monkey,
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二、樣本要求
在收集標本前都必須有一個完整的計劃，必須清楚要檢測的成份是否足夠穩定。我們提倡新鮮標本盡早檢測，對收集后當天就進行檢測的標本，及時儲存在4℃備用，如有特殊原因需要周期收集標本，請造模取材后，將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差，蛋白極易降解，直接影響實驗質量，所以避免反復凍融。代測放免標本的客戶取材前須向我司銷售人員索要說明書，具體操作注意事項請與我司技術人員溝通。
液體類標本：標本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養上清、組織勻漿等。
血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。收集上清。如有沉淀形成，應再次離心。
血漿：應根據試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10%（v/v）抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1%heparin
或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。如有沉淀形成，應再次離心。
尿液、胸腹水、腦脊液：用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。如有沉淀形成，應再次離心。
細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.0-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，緩沖液中可加入1μg/L蛋白酶抑制劑或50U/ml的Aprotinin（抑肽酶）。用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清置于-20度或-70度保存，如有必要，可以將樣品濃縮干燥。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
三、寄標本時需注明以下情況：
1、標本編號；2、所測項目；3、是否做復孔；3、聯系方式；4、實驗后標本是否寄回。
客戶須知：
客戶應對所提供的材料及信息負責，如因客戶提供的材料及信息不準確而引起的實驗延誤或經濟損失由客戶承擔。
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原代細胞培養問 題
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組織塊直接培養法
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1.
取材，用
Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
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2.
用手術剪將組織剪切成
1mm3左右的小塊，再用Hank's液洗三次。
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3. 將組織塊轉移至培養瓶，并貼附于瓶底面。
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4.
輕輕將培養瓶翻轉，瓶底朝上，向瓶內注入適量的培養液，將培養瓶放置在
37℃恒溫箱內培養。
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5.
放置待組織小塊貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，使組織浸入培養液中
37℃繼續培養。
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消化培養法
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1.
取材，用
Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
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2.
用手術剪將組織剪切成
1mm3左右的小塊，再用Hank's液洗三次。
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3.
視組織塊量加入酶液，
37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
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4.
加入
3—5ml培養液以終止酶消化作用（或加入相關酶抑制劑）。
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5.
靜置
5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
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6. 1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。
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7.
加入
Hank's液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
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8.
加入培養液
1—2ml（視細胞量），血球計數板計數。
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9.
將細胞轉移到培養瓶中，
37℃下培養。
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器官培養法
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1.
將不銹網做成支架形狀，調整其高度至培養皿的
1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。
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2. 將培養液加入培養皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。
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3.
將要培養器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過
200μm，水平面積不超過10mm2。
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4.
將上述準備好的培養物放入
CO2培養箱，并加注氧氣調整氧分壓，建議到90%。
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5. 培養過程中要注意觀察培養液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。
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6.
上述可進行器官培養
1-3周，每2-3天換液一次，并根據情況做進一步實驗和檢測。
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