T150燒瓶 : 07-200-64
T75燒瓶 : 10-126-37
冷 凍 劑 : 03-374-059
45um過濾器 : 09-754-21
05%胰蛋白酶 : sh30236.01
25%胰蛋白酶 : sh30042.01
惰性譜線 : MOC1,22
侵略性線 : MOC2
IMDM : sh30228.02 Hams
營養混合物 : F10-F12sh30026.01胎牛血清，特征-海克隆
目錄 / 批次號 : sh30071.03 / AWK24001
過濾1L過濾器瓶的過濾器 : 09-761-108
科學試劑目錄編號 : 胰島素：I6634-50mg 氫化可的松：H0135-1mg
EMD微孔試劑目錄編號 : 表皮生長因子(EGF)，重組人：01-107
解凍細胞系
1. 在解凍前，將21ml IMDM MOC線培養基加入到T150中(如果想解凍成T75，則將10ml加入到T75 中）
2. 將液氮從冷凍瓶中取出，噴上含有70%酒精的小瓶進行清洗。
3. 將冷凍瓶的下半部分放在37攝氏度的水浴中(不讓蓋子接觸水，以避免污染），直到 有一小塊冰漂浮著。
4. 再次用ETOH噴灑冷凍瓶，然后放在引擎蓋上。將1ml培養液移液管加入到1ml細胞中，并將這 些2ml加入到已經含有培養基的T150中(使一個T150總共有22ml)。
5. 在T150燒瓶中取一些培養基，沖洗冷凍瓶，然后平板放置，以確保所有殘留的細胞都留在冷 凍瓶中。
冷凍細胞系
1. 從T150中收集細胞，如下圖所示
2. 在15ml錐形管中旋轉成顆粒(1000 RPM x5分鐘）
3. 排出上清液
4. 點擊15ml圓錐形管，重懸細胞
5. 加入1.5ml IMDM MOC系培養基，在培養基中重建細胞-保持冰上
6. 管入冰時緩慢加入1.5 ml冷凍介質(在IMDM MOC線介質中制作冷凍介質-20%DMSO。例：20ml庫存-加入16ml IMDM MOC線培養 基和4ml DMSO。注射器過濾器，使用um過濾器
7. 每份1毫升到3個冷凍瓶
8. 在-80攝氏度內儲存不超過2周
9. 在1-2周內放入液氮溶液中
注 ： 如果需要，可增加到2ml IMDM和2ml冷凍培養基，以儲存在4個小瓶中。此外，最好在冷凍細胞 前計數細胞并記錄在小瓶上。
細胞系特征
1. 惰性- MOC1：基于體內研究的侵襲性較低。如果從80%合流T150通過1：12，需要2-4天才能達到80%合 流。與更具侵襲性的細胞系相比，MOC1細胞系在收獲時需要的時間更長。
2. 侵襲性- MOC2：基于體內研究，更具侵襲性。如果從80%合流T150通過1：12，需要2-4天才能達到 80%合流。與惰性細胞系相比，惰性細胞系更容易從燒瓶中分離出來。
從T150收集和傳遞細胞/80%融合
1. 將T150中的介質倒入傾倒瓶中
2. 用10-20ml PBS清洗一次。倒出PBS清洗液。
3. 加入1.5ml 0.05%胰蛋白酶，尖端瓶，確保胰蛋白酶覆蓋整個表面積，從而接觸所有細胞(這樣做，使細胞不會暴露在胰蛋白酶中太久)，排出胰蛋白酶，然后再應用1。5ml0.25%胰蛋 白酶。
4. 放置在37C培養箱中。侵襲性細胞系孵育3-4分鐘，惰性反應可達10-12 min，但在6-8 min后 檢查。
5. 故意敲擊燒瓶一側的手掌幾次，使細胞松動。
6. 在顯微鏡下檢查，看細胞在培養基中是否能自由漂浮。如果大多數沒有，請放回37C培養箱中 再放置3-5分鐘。盡量不要讓細胞在胰蛋白酶中停留，因為這樣會殺死細胞。
7. 一旦所有或大部分細胞漂浮，加入10ml IMDM MOC線培養基來中和反應。
8. 移液管培養基和細胞從燒瓶中進入15ml的錐形細胞到顆粒細胞。離心機，1000 RPM x 5 min。
9. 倒出上清液。
10. 以1：12的速度通過細胞-在另外12毫升的培養基中重懸細胞。
11. 從其中取出1ml，放入新的T150燒瓶中，總體積為22ml的IMDM MOC系培養基(稀釋1：12）
1２. 放回37C的培養箱中生長。應在2-4天內達到80%的合流率。
注入小鼠側腹（異位）所需細胞濃度：
MOC1：MOC22：(用0.15ml注射1e6細胞）=6.66e6細胞/ml
MOC2：(用0.15ml注射1e5細胞)=6.66e5細胞/ml
1. 用0獲取細胞。25%的胰蛋白酶，如上所述。
2. 用IMDM MOC系培養基中和胰蛋白酶后，將細胞旋轉成50ml錐形的顆粒(1000 RPM x5分鐘)。 注：使用50ml錐形，允許小尺寸針抽出細胞供注射。
3. 用10ml冰水PBS重懸細胞顆粒(確保盡可能多地去除含有FCS的介質)，再次將細胞旋轉成顆 粒(1000 RPM x5分鐘)
4. 用3-6 ml冰PBS重懸細胞顆粒再次清洗細胞(體積取決于顆粒的大小，因為你將使用這個體積 來計數細胞）
5. 使用血細胞計數儀或自動細胞計數器計數每毫升的細胞，使用臺盼藍來消除死亡細胞。使用 存在的細胞總數(細胞/mlx總PBS的mlPBS)，計算重懸細胞顆粒所需的體積，以達到6.66e6(MOC1，MOC22)或6. 66e5 cell/ml(MOC2)濃度。
例如：MOC1的細胞計數為： 2.8e6細胞/mlx5ml(PBS)=14e6細胞總數。14e6細胞/ 6.66e6細胞/ml=2.1mlPBS將細胞顆粒懸浮在其中。
6. 再次將細胞旋轉成小顆粒。倒出PBS上清液(不)。在計算體積的冰PBS中重懸顆粒以達到 適當的濃度，記住灌注上清后50ml錐形中還有 200ul。
7. 將50ml錐形冰轉移，每只小鼠皮下注射0.15ml(150ul)細胞。
8. 按照標準協議注入鼠標。我們用1毫升注射器。我們用1.5英寸21號針繪制細胞，并將針切換 到½英寸26號針進行注射。
1L媒體協議
將培養基為2：1 IMDM制成營養混合物
1. 解凍胎牛血清和賓州/鏈球菌在37攝氏度
2. 1L過濾瓶加入626ml IMDM和313ml營養混合物
3. 添加50毫升FCS
4. 添加10ml Penn流
5. 過濾器
6. 加入1ml5mg/ml胰島素(或500ul，10mg/ml)
注：用10ml無菌H20稀釋胰島素50mg粉末，加50ul無菌1N鹽酸，4C箔保存
7. 加入40ug氫化可的松
注：將Sigma中氫化可的松酮稀釋1mg氫化可的松粉制成19ml無血清IMDM和1ml 100%乙醇，制成20ml。每升使用800ul。在-20處存儲等分。
8. 添加5ug EGF
注：使EGF - make 1ug/ul原液用無血清IMDM稀釋，每升加入5ul。在-80處存儲等分。
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