乳鐵蛋白(LTF)ELISA試劑盒
簡(jiǎn)介
乳鐵蛋白，也被稱為乳鐵傳遞蛋白（LTF），是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的一種多功能蛋白。乳鐵蛋白是一種球狀糖蛋白，分子質(zhì)量約為80 kDa，廣泛存在于各種分泌液中，如牛奶、唾液、眼淚和鼻腔分泌物。乳鐵蛋白也存在于PMNs的次級(jí)顆粒中，并由一些尖頂細(xì)胞分泌。乳鐵蛋白可從牛奶中提純或重組生產(chǎn)。乳鐵蛋白是人體免疫系統(tǒng)的組成部分之一；它具有抗菌活性（殺細(xì)菌、殺真菌），是先天防御的一部分，主要是在粘膜。乳鐵蛋白與DNA和RNA、多糖和肝素相互作用，并在與這些配體的復(fù)合物中顯示其一些生物功能。
本試劑盒LTF 免疫測(cè)定是一種兩步法固相ELISA，用于測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的LTF。試劑盒包含大腸桿菌表達(dá)重組LTF 和針對(duì)重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然LTF 獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測(cè)定天然LTF 的相對(duì)質(zhì)量值。
檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將乳鐵蛋白 (LTF) 捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的LTF，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗Human-LTF抗體，與LTF結(jié)合形成“抗體-抗原-抗體-HRP”免疫復(fù)合物，加入TMB顯色后，若樣本中有LTF則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的乳鐵蛋白 (LTF) 的含量呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中LTF的濃度。
雙抗體夾心模式圖
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按操作順序形成抗體夾心結(jié)構(gòu)后，加入TMB 底物，板孔液體由無(wú)色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測(cè)定。
檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性
僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。
試劑盒的使用期限不得超過(guò)試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來(lái)源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)
混合蛋白質(zhì)溶液時(shí)，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨(dú)使用容器。
確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準(zhǔn)確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。
當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。
顯色劑應(yīng)保持無(wú)色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水
4. 100-1000 mL刻度量筒。
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)。
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
注意事項(xiàng)
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。
細(xì)胞培養(yǎng)上清液：
以1000×g離心20分鐘，去除顆粒，立即進(jìn)行測(cè)定或等分裝樣品，并將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，細(xì)胞培養(yǎng)上清液樣品建議10倍稀釋。例如：20μL樣品+180μL的1×稀釋液）
血清：
使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進(jìn)行測(cè)定或等分裝樣品，將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
血漿：
使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內(nèi)，以1000×g離心15分鐘。立即測(cè)定或等分裝樣品，并將樣品儲(chǔ)存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液）
注：
檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經(jīng)驗(yàn)證可用于本試驗(yàn)，使用時(shí)應(yīng)自行驗(yàn)證可行性。溶血的樣品不適合用于該測(cè)定。
組織勻漿：用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機(jī)研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測(cè)。
細(xì)胞裂解液：
貼壁細(xì)胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗3次，每1×106個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通過(guò)反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測(cè)。
其它樣本類型：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置：
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將180ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200uL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至5000pg/mL（例：28uL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+972uL的1×稀釋液，制備得到1000μL的5000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將5000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.13pg/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。
酶標(biāo)抗體工作液配置:
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)抗體稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：
如待測(cè)樣本中LTF濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配置工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長(zhǎng)時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)
1.酶標(biāo)板準(zhǔn)備：確定試驗(yàn)所需要的孔數(shù)，取下未使用的酶標(biāo)條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。
2.樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以及預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品，蓋上封板膠紙?jiān)?7℃下孵育45分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
3.二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙?jiān)?7℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟2中的清洗步驟4次。
4.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙?jiān)?7℃下避光孵育10-20分鐘。（根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）
5.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
精密度
操作內(nèi)精密度（測(cè)定中的精密度）在一塊平板上對(duì)兩個(gè)已知濃度的樣品進(jìn)行20次測(cè)試，以評(píng)估測(cè)定內(nèi)精密性。
操作間精度（測(cè)定間精度）在10個(gè)單獨(dú)的測(cè)定中測(cè)試兩個(gè)已知濃度的樣品，以評(píng)估測(cè)定間精度。至少有三名技術(shù)人員進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。
回收率
回收率在不同基質(zhì)的整個(gè)測(cè)定范圍內(nèi)選取在健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入3個(gè)不同濃度水平的LTF，計(jì)算回收率。
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為39.06pg/mL
線性關(guān)系
分別在選取的4份健康人血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度LTF，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。
特異性
該試劑盒測(cè)定可識(shí)別天然和重組LTF。
其他相關(guān)因子在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
實(shí)驗(yàn)步驟匯總1.加標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，37℃反應(yīng)45分鐘，洗滌3次。
2.加酶標(biāo)抗體，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
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