烏頭堿(ANT)ELISA試劑盒
簡介
烏頭堿（Aconitine）是一種高度復(fù)雜的生物堿，主要來源于烏頭屬植物的根部（如川烏、附子等），烏頭堿的生物活性表現(xiàn)為通過抑制Na+-K+-ATP酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈉、鉀、鈣離子平衡失調(diào)，影響神經(jīng)遞質(zhì)的正常釋放和傳遞；它還可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（Glu）的異常分泌，進(jìn)一步加劇神經(jīng)毒性。在生物體內(nèi)的代謝途徑主要涉及肝臟和腎臟，烏頭堿首先在肝臟中通過細(xì)胞色素P450酶（CYP450）系統(tǒng)進(jìn)行代謝，主要的代謝酶包括CYP3A4、CYP1A1/2、CYP3A4/5和CYP2D6。這些酶將烏頭堿轉(zhuǎn)化為毒性較低的衍生物，如7-羥基烏頭堿和烏頭堿-3-O-硫酸鹽。
本酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可以經(jīng)濟(jì)、快速地樣本中的ANT的殘留量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中ANT和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭ANT抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的ANT成負(fù)相關(guān)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量樣品中ANT的含量。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實(shí)際樣品中ANT的含量。
間接競爭法模式圖
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按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測定。
檢測實(shí)驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗設(shè)計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)
為了避免交叉污染，在添加每個標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。
當(dāng)使用自動洗板機(jī)時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。
顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，450nm/630nm
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水
4. 100-1000 mL刻度量筒。
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機(jī)。
6. 恒溫培養(yǎng)箱
7. 振蕩器
8. 天平（感量0.01g）
9. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
10. 50mL離心管
注意事項
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評估。
1.血清：將收集于血清分離管的全血樣本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集樣本，將樣本 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
3. 組織勻漿：用 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng) 9mL的PBS）。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液 3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
5. 尿樣：取尿樣本上清50µL進(jìn)行檢測。（如混濁需離心或過濾）
樣品稀釋倍數(shù)：0.5倍
6. 其它生物標(biāo)本：3000r/min 離心10min，取上清即可檢測。
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱至晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個試管，先將100ppm標(biāo)準(zhǔn)品（100µL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至3645 ppb（例：36µL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+964µL的1×稀釋液，制備得到1000μL的3645 ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個試管中分別加入600μL的1×稀釋液，在這6個單獨(dú)的試管中將3645 ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次3倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：3645 ppb、1215 ppb、405 ppb、135 ppb、45 ppb、15 ppb、5 ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取300μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：
如樣本中待測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗之前做預(yù)實(shí)驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗為長時間跨度實(shí)驗，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗結(jié)果的穩(wěn)定性）
實(shí)驗步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過的待測樣品，同時加入抗試劑50µL/孔（加抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗步驟3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗步驟4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為5 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù) r 值，大于等于0.9970。
交叉反應(yīng)性
烏頭堿：100%
實(shí)驗步驟匯總
1.加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計算
以濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
找尋抗體，試劑，細(xì)胞裂解液，試劑盒
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