甲硝唑檢測(cè)試劑盒使用說明書
（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA 方法檢測(cè)組織、蜂蜜等樣本中的甲硝唑（Metronidazole，MNZ），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，樣本中的甲硝唑和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗甲硝唑抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光度值與其所含甲硝唑含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中甲硝唑的殘留量。
2 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃ 30min～30min～15min
2.3 檢測(cè)下限：
組 織（雞、鴨肉/肝臟、魚、蝦、等）…………0.25ppb
蜂蜜 ………………………………………………0.25ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
與類似物的交叉反應(yīng)率：
甲硝唑(MNZ) ………………………………………100%
二甲硝咪唑 DMZ……………………………………68%
2.5 樣本回收率：
魚/蝦/禽/肝臟………………………………90±10%
蜂蜜樣本 ……………………………………90±10%
3 試劑盒組成
酶標(biāo)板 1 塊，96 孔/板標(biāo)準(zhǔn)
液 6 瓶（黑蓋）：1ml/瓶
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb 高標(biāo)準(zhǔn)液 100 ppb ………………………………1ml
抗體工作液 (藍(lán)蓋)………………………………5.5ml
酶標(biāo)記物 (紅蓋)…………………………………11ml
底物液 A (白蓋)……………………………………6ml
底物液 B(黑蓋) ……………………………………6ml
終止液(黃蓋) ………………………………………6ml
20X 濃縮洗滌液(白蓋)……………………………40 ml
2X 濃縮復(fù)溶液(黃蓋)…………………………… 50 ml 說
明書………………………………………………1 份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 300µl
4.3 試劑：NaOH、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙酯 4 需要的器材和試劑 4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩 器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、恒溫箱 4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 300µl 4.3 試劑：NaOH、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、正己烷、乙酸乙 酯
2）加入 9ml 乙酸乙酯，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分，離心5 分鐘；
3）取上層有機(jī)相 6ml 至另一離心管中，加入 2ml 乙酸乙酯，2ml 2M 氫氧化鈉溶液，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分，離心 5 分鐘；
4）取 4ml 清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中，30～40℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
5）加入正己烷 1ml，渦動(dòng) 30s，再加入 0.5ml 復(fù)溶液混合 30秒，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分以上，離心 5 分鐘；
6）去除上層有機(jī)相，取下層 50µl 液體用于分析。稀釋倍數(shù) 0.5 檢測(cè)下限 0.25ppb
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5.2 配液：
配液 1：0.1M 碳酸鹽緩沖液稱取 4.66g 無水碳酸鈉，0.5g 碳酸氫鈉去離子水 500ml 溶解，pH 10.6 。
配液 2：2M 氫氧化鈉溶液 稱取 40g 氫氧化鈉，加入去離子水 500ml 溶解。
配液 3：洗滌液將濃縮洗滌液 20 倍稀釋(1 份洗滌液加 19 份去離子水)。
配液 4：復(fù)溶液將2×復(fù)溶液用去離子水 2 倍稀釋（1 份復(fù)溶液加 1 份去離子水）,用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在 4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組 織（雞、鴨肉/肝臟、魚、蝦、等）、蜂蜜 1）取 3g樣本，加 3ml 0.1M 碳酸鹽緩沖溶液振蕩至蜂蜜全部
2）加入 9ml 乙酸乙酯，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分，離心5 分鐘；
3）取上層有機(jī)相 6ml 至另一離心管中，加入 2ml 乙酸乙酯，2ml 2M 氫氧化鈉溶液，振蕩 5 分鐘，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分，離心 5 分鐘；
4）取 4ml 清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中，30～40℃氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>
5）加入正己烷 1ml，渦動(dòng) 30s，再加入 0.5ml 復(fù)溶液混合 30秒，室溫 4000 轉(zhuǎn)/分以上，離心 5 分鐘；
6）去除上層有機(jī)相，取下層 50µl 液體用于分析。稀釋倍數(shù) 0.5 檢測(cè)下限 0.25ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟
將所需試劑從 4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于 2-8℃。
6.1 編 號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液 50µl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗 滌：將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液 250µl/孔充分洗滌 5 次，每次間隔 30 秒，最后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應(yīng)：加酶標(biāo)記物 100µl/孔，25℃避光反應(yīng) 30 分鐘。
6.5 洗滌：同上
6.6 顯 色：加底物液 A 50µl/孔，再加底物液 B 50µl/孔，輕輕振蕩 5 秒混勻，25℃避光顯色 15 分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間）。
6.7 終止：每孔加入終止液 50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于 450nm 處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng) 450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后 10 分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸
光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度 值，再乘以 100%，即
A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>
8 注意事項(xiàng)
8.1 室溫低于 25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0 標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于 0.5 個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲(chǔ)藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
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